把目的基因连接到质粒上构建重组质粒时该如何选择限制性内切酶?引物如何设计？

有许多方法，其中列出了一种或两种：

1。

不同的粘性端无法连接。所以，如果我们想连接，我们需要删除不同的粘性端和连接平端。

有两种方法可以将粘性端变为平端：Klenow酶或S1核酸酶。

为了减少载体自连接，碱性磷酸酶可用于治疗载体。

最后，将载体与目的基因连接，构建重组质粒。

[2.

设计引物，用其自身的限制性位点扩增目标基因。直接改变目的基因的限制性位点，用与载体相同的限制性内切酶对目的基因进行酶切，切出相同的粘端。

目标基因与载体直接连接。

怎样设计引物克隆已经构建好的t载体基因来构建表达载体？

如果T载体上没有限制性位点，则应重新设计具有限制性位点的引物。PCR扩增后，将T载体酶切后与表达载体连接。如果T载体上有必要的限制性位点，则直接限制后可恢复目的片段并连接到表达载体上。

构建载体的时候，先用设计好的引物PCR所要的目的基因，再和T载体连接，再转化，再小抽，再双酶切，再和？

理论上，PCR产物可以直接消化和连接。

但是，用酶消化PCR产物时，无法证明双酶消化的成功和彻底（PCR产物会有polyA，必须切断，但PCR产物和酶消化产物的大小差别不大）。以t载体为培养基，双酶消化t载体，凝胶运行检测能清晰地看到酶消化产物，并有特异性回收。